Podsumowanie czynników białkowych zaangażowanych w hodowlę komórek macierzystych układu krwiotwórczego
Źródło: T&L Biotechnology Data wydania: 2023-07-13
Wstęp
W ostatnich latach Komórka macierzystas stały się coraz szerzej stosowane w zastosowaniach klinicznych. Jednak proporcja i ilość komórek macierzystych w ciele człowieka są niezwykle niskie, co nie może sprostać potrzebom klinicznym. Dlatego ekspansja i hodowla komórek macierzystych in vitro stały się coraz ważniejsze. Ze względu na względy etyczne i technologiczne leczenie komórek macierzystych nadal napotyka wiele problemów. Markery powierzchniowe komórek macierzystych/progenitorowych układu krwiotwórczego i różnych linii komórek krwi są stosunkowo jasne, a cechy fenotypowe komórek można ilościowo wybrać, oddzielić, a ich funkcje mogą być stosunkowo swobodne, bez potrzeby złożonych procesów downstream, takich jak „biologiczne rusztowania” do przeszczepów nerwowych, naczyniowych i chirurgicznych. Dlatego jest to najlepszy model ekspansji i różnicowania komórek macierzystych, a także wygodny do bezpośredniego zastosowania klinicznego.
Komórki macierzyste układu krwiotwórczego mają wysoki stopień samoodnawiania i potencjał wielokrotnego różnicowania. Mogą produkować wszystkie dojrzałe komórki krwi, takie jak czerwone krwinki, białe krwinki, płytki krwi i limfocyty, i mogą odbudować cały układ krwiotwórczy. Ekspansja komórek macierzystych układu krwiotwórczego in vitro wymaga utrzymania ich zdolności do samoodnawiania, a jednocześnie zapobiegania ich różnicowaniu, co czyni ją wysoce trudną technologią. W ostatnich latach duża liczba eksperymentów wykazała, że różnicowanie komórek macierzystych układu krwiotwórczego zależy od cytokin. Krótko podsumujemy czynniki i ich skutki stosowane w hodowli komórek macierzystych układu krwiotwórczego.
Czynnik komórek macierzystych (SCF)
Czynnik komórek macierzystych (SCF) to czynnik, który działa poprzez zakotwiczenie i ekspresję receptora tyrozynowego c-Kit na powierzchni wszystkich komórek macierzystych krwi (HSC). Wadliwa ekspresja c-Kit prowadzi do zmniejszenia liczby ekspansji komórek macierzystych krwi (HSC). Obecnie prawie wszystkie kombinacje cytokin stosowane w eksperymentach z hodowlą komórek macierzystych krwi (HSC) zawierają SCF. Ponadto zarówno SCF, jak i FL3 należą do rodziny receptorów kinazy tyrozynowej TKR, która ma synergistyczny wpływ na ekspansję pierwotnych komórek hematopoetycznych. Poprzez wiązanie się ze specyficznym TKR, SCF przekazuje sygnały do komórek, inicjując wczesny podział i ekspansję komórek progenitorowych, umożliwiając komórkom rozpoczęcie ekspansji i hamując apoptozę po zakończeniu fazy G0.
Trombopoetyna（Tpo）
Początkowo uważano, że TPO jest specyficznym czynnikiem wzrostu dla megakariocytów, należącym do kategorii swoistych cytokin działających, które mogą utrzymywać ekspansję, różnicowanie, dojrzewanie, podział i formowanie funkcjonalnych płytek krwi w megakariocytach. Jest to preferowany czynnik do ekspansji megakariocytów. W ostatnich latach eksperymenty potwierdziły, że TPO odgrywa ważną rolę w promowaniu ekspansji HSC w badaniach in vitro, a w połączeniu z innymi cytokinami może zwiększyć całkowitą liczbę jednostek tworzących kolonie i fałd ekspansji komórek macierzystych CD34+. Szczególnie w kombinacjach FL3 może utrzymywać długoterminowy wzrost i ekspansję komórek macierzystych CD34+ krwi pępowinowej.
Interleukina-3 (IL-3)
Interleukina-3 (IL-3), znana również jako masKomórka T czynnik wzrostu, jest plejotropową cytokiną produkowaną głównie przez aktywowane limfocyty T, która może stymulować proliferację i różnicowanie pluripotentnych komórek macierzystych HSC i różnych zorientowanych na linie komórek progenitorowych. Po indukowanej przez IL-3 heterodimeryzacji receptorów powierzchniowych komórek macierzystych, mogą one wiązać się z wieloma białkami transdukcji sygnału, takimi jak szlak przekaźnika sygnału kinazy Janus i aktywatora transkrypcyjnego (JAK/STAT), stymulując w ten sposób zmniejszony przepływ sygnału i uczestnicząc w regulacji ekspansji komórek macierzystych. IL-3 może również aktywować szlak kinazy regulowanej sygnałem pozakomórkowym (ERK) i szlak aminotransferazy c-jun (JNK), indukując wzrost, ekspansję i przeżycie komórek macierzystych.
Interleukina-6 (IL-6)
IL-6 to wielokierunkowa cytokina, która odgrywa ważną rolę w obronie gospodarza poprzez regulację odpowiedzi immunologicznej i zapalnej. IL-6 jest wytwarzana przez komórki T, monocyty, fibroblasty, komórki śródbłonka i keratynocyty i ma wiele funkcji biologicznych. Może promować różnicowanie komórek B i produkcję przeciwciał, synergistycznie IL-3 odgrywa rolę w rozwoju megakariocytów i produkcji płytek krwi, indukuje ekspresję białek fazy ostrej w wątrobie i reguluje metabolizm kości. IL-6 przekazuje sygnały przez układ receptorów IL-6, który składa się z dwóch łańcuchów: IL-6Rα i gp130. STAT3 jest decydującą cząsteczką w utrzymaniu niezróżnicowanego stanu komórek macierzystych zarodka, podczas gdy IL-6 jest początkowym promotorem szlaku sygnałowego JAK/STAT3.
Ligand LFLT3 (FL)
Ligand FLT3 jest czynnikiem wzrostu, który reguluje wczesną ekspansję komórek hematopoetycznych. Ligand FLT3 wiąże się z komórkami ekspresującymi receptor kinazy tyrozynowej FLT3. Sam ligand FLT3 nie stymuluje ekspansji wczesnych komórek hematopoetycznych, ale raczej synergicznie indukuje wzrost i różnicowanie z innymi płynami mózgowo-rdzeniowymi i interleukinami. W przeciwieństwie do SCF, ligand FLT3 nie ma wpływu na komórki tuczne. Zidentyfikowano wiele podtypów ligandu FLT3. Główna forma bioaktywna jest zakotwiczona na powierzchni komórki jako domena zewnątrzkomórkowa białka transbłonowego (209a.). Izomer związany z błoną może zostać rozszczepiony przez białka w celu wytworzenia biologicznie aktywnych rozpuszczalnych izomerów.
FMS-Lukrecja chińska 3
Kinaza tyrozynowa 3 typu FMS (FL3) silnie ekspresjonowana w komórkach CD34+CD38dim przekazuje sygnały do komórki poprzez wiązanie się ze specyficznymi receptorami kinazy tyrozynowej (TKR). FL3 działa na HSC/HPC i wywiera regulację hematopoetyczną poprzez wiązanie się z TKR na powierzchni komórki. FL3 jest również bardzo ważnym wczesnym czynnikiem stymulującym komórki progenitorowe, który ma znaczący wpływ promujący ekspansję HSC/HPC in vitro. Może zapobiec stopniowemu różnicowaniu się komórek macierzystych CD34+ i wyczerpywaniu HPC podczas ekspansji in vitro.
Transformujący czynnik wzrostu-β
Transformujący czynnik wzrostu-β、Transformujący czynnik wzrostu-β1, podtypy β3 ssaków emitują sygnały przez ten sam receptor, powodując podobne reakcje biologiczne. Są to wielofunkcyjne cytokiny, które regulują ekspansję, wzrost, różnicowanie i ruch komórek, a także syntezę i depozycję macierzy zewnątrzkomórkowej. Transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β) jest wytwarzany przez komórki podścieliska szpiku kostnego. Hamuje on wczesne HSC/HPC przed wejściem w fazę S, powodując, że większość HSC/HPC znajduje się w fazie G0.
Białko zapalne makrofagów-1 α
Białko zapalne makrofagów-1β (MIP-1β) jest naturalnym antagonistą MIP-1α, któremu towarzyszy. Może łagodzić hamujący wpływ MIP-1α na wczesne HSC/HPC i zapobiegać powrotowi HSC do stanu spoczynku.
P38
P38, jako cząsteczka sygnałowa należąca do rodziny kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK), hamuje ekspansję HSC in vitro w warunkach normoksji. Eksperymenty wykazały, że gdy HSC są dodawane do pożywek hodowlanych bez surowicy zawierających TPO, SCF i FL3, stres oksydacyjny aktywuje p38 i p16, co prowadzi do znacznego zmniejszenia liczby mysich HSC.
Czynnik stymulujący kolonie granulomakrofagów (GM-CSF)
Czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów jest lekiem stosowanym klinicznie w różnych przypadkach leukopenii lub granulocytopenii. Obecnym środkiem mobilizującym komórki jest czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF), który nie tylko zwiększa liczbę komórek macierzystych układu krwiotwórczego we krwi obwodowej, ale także wspomaga pracę serca i inne funkcje.
Czynnik stymulujący kolonie granulocytów (G-CSF)
Efekty czynników stymulujących kolonie granulocytów obejmują na ogół prezentację antygenu, wzmocnienie funkcji makrofagów i promowanie ekspansji komórek macierzystych układu krwiotwórczego. Czynnik stymulujący kolonie granulocytów jest silnym czynnikiem mobilizującym komórki macierzyste szpiku kostnego, który może stymulować ekspansję autologicznych komórek macierzystych szpiku kostnego i mobilizować je ze szpiku kostnego do krwi obwodowej.
Erytropoetyna (EPO)
Erytropoetyna (EPO) jest głównym czynnikiem stymulującym różnicowanie hematopoetyczne, który może promować różnicowanie komórek macierzystych układu krwiotwórczego w pierwotne czerwone krwinki, przyspieszać podział i ekspansję młodych czerwonych krwinek, promować syntezę hemoglobiny, a także odgrywać ważną rolę w badaniu różnicowania się czerwonych krwinek.
Komórki macierzyste układu krwiotwórczego mają potencjał do samoodnawiania i wielokierunkowego różnicowania. Połączenie różnych czynników ma różny wpływ na ekspansję komórek macierzystych układu krwiotwórczego. Zastosowanie komórek macierzystych układu krwiotwórczego może selektywnie indukować produkcję wielu komórek, co niewątpliwie dostarcza nowych pomysłów na ekspansję komórek NK. Obecnie komórki NK można indukować z komórek macierzystych zarodka i iPSC, ale zarówno komórki macierzyste zarodka, jak i indukowane komórki macierzyste pluripotentne muszą zostać przekształcone w komórki macierzyste układu krwiotwórczego, zanim będą mogły różnicować się w komórki NK. Dlatego komórki macierzyste układu krwiotwórczego odgrywają niezastąpioną rolę w tym procesie. Zalety komórek NK pochodzących z komórek macierzystych polegają na tym, że można je stosować na żądanie, mają silną jednorodność, niskie uwalnianie cytokin i silną aktywność zabijania. Dlatego też na rynku nadal panuje duży entuzjazm dla eksploracji komórek NK pochodzących z komórek macierzystych. Istnieją prace literaturowe na temat indukcji komórek macierzystych w komórki NK. Skupiamy się głównie na czynnikach wymienianych w literaturze.
1. Komórki NK pochodzące z ludzkich komórek macierzystych zarodkowych
Komórki HESC przeniesiono do współhodowli z linią komórek podścieliska szpiku kostnego myszy M210-B4 w podłożu zawierającym RPMI 1640, 15% zdefiniowanej surowicy płodowej bydlęcej, 2 mM L-glutaminy, 1% nieistotnych aminokwasów, 1% penicyliny/streptomiocyny i 0,1 mM -merkaptoetanolu, zmieniając podłoże co 2 do 3 dni, jak opisano wcześniej. Po 17 do 20 dniach przygotowano zawiesinę pojedynczych komórek i wyizolowano komórki CD34+CD45+, jak opisano wcześniej. Wyizolowane komórki przeniesiono do drugiej współhodowli z linią komórek podścieliska wątroby płodowej myszy AFT024 w podłożu zawierającym mieszaninę 1:2 podłoża Eagle'a zmodyfikowanego przez Dulbecco/Ham F12, 20% inaktywowanej cieplnie surowicy ludzkiej AB, 2 mM L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomiocyny, 5 ng/ml selenianu sodu, 50 μM etanoloaminy, 25 μM -merkaptoetanolu, 20 mg/ml kwasu askorbinowego, interleukiny-3, czynnika komórek macierzystych, IL-15, ligandu kinazy tyrozynowej 3 podobnej do Fms i IL-7. Komórki karmiono świeżym podłożem, zmieniając połowę podłoża co 5 do 6 dni. Po 30 do 35 dniach hodowli komórki zebrano, przefiltrowano przez filtr 70 μm i wykorzystano do dalszej analizy.
2. Komórki NK pochodzące z ludzkich komórek macierzystych pluripotentnych
Pobieramy komórki 18–21-dniowe do wzbogacenia komórek progenitorowych CD34+ CD45+. Sto tysięcy komórek CD34+ CD45+ umieszczono na podłożu EL08-1D2 z 1 ml cytokin inicjujących komórki NK (IL-3, IL7, IL-15, czynnik komórek macierzystych i ligand receptora kinazy tyrozynowej podobnej do fms-3). Hodowle komórek NK odświeżaliśmy 0,5 ml podłoża zawierającego cytokiny co 4–5 dni. Dojrzałe komórki NK mierzono po 28–35 dniach hodowli na EL08-1D2.
Cytokiny i czynnik wzrostu związane z komórkami macierzystymi T&L
O firmie T&L
Firma T&L Biotechnology Ltd., założona w 2011 r., koncentruje się na badaniach i rozwoju surowców i odczynników klasy GMP w górnym biegu łańcucha dostaw terapii komórkowej i genowej (CGT). Zobowiązujemy się do dostarczania niezawodnych produktów i usług dla nauk przyrodniczych