„MaxSortin®“ CD4 izoliacijos rinkinys

„MaxSortin®“ CD4 atskyrimo rinkinys gali būti naudojamas žmogaus CD4+ T ląstelėms rūšiuoti. CD4+ T ląsteles galima rūšiuoti inkubuojant nanoskalės CD4 atskyrimo magnetinius karoliukus su ląstelėmis. Nanoskalės CD4 atskyrimo magnetiniai karoliukai inkubuojami su periferinio kraujo mononuklearinėmis ląstelėmis (PKL), o po to atlieka magnetinį atskyrimą, kuris leidžia atskirti ir praturtinti CD4+ T ląsteles, atliekant vaidmenį gryninant CD4+ T ląsteles ir taikant jį ląstelių terapijos produktų gamyboje.

1. Žmogaus periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių (PBMC) suspensiją supilkite į PBS buferį, kuriame yra 1 % žmogaus serumo albumino (HSA). Paimkite mėginį skaičiavimui ir perkelkite 1 × 10⁷ ląstelių į 1,5 ml EP mėgintuvėlį. Tada centrifuguokite 1500 aps./min. greičiu 5 minutes.
2. Išpilkite supernatantą, paimkite 80 μL „MaxSortin®“ ląstelių rūšiavimo buferio ląstelėms resuspenduoti, įpilkite 20 μL CD4 atskyrimo magnetinių granulių, gerai išmaišykite ir padėkite į šaldytuvą 2–8 °C temperatūroje 15 minučių inkubacijai.
3. Paimkite „MaxSortin®“ L atskyrimo kolonėlę, uždėkite ją ant magnetiniu būdu aktyvuoto ląstelių rūšiavimo (MACS) rūšiavimo įrenginio ir du kartus praskalaukite 1 ml „MaxSortin®“ ląstelių rūšiavimo buferio.
4. Išimkite iš šaldytuvo 2–8 °C temperatūroje inkubuotą mėginį, įpilkite 1 ml MACS tirpalo, centrifuguokite 1500 aps./min. greičiu 5 minutes ir išpilkite supernatantą.
5. Įpilkite 1 ml „MaxSortin®“ ląstelių rūšiavimo buferio ląstelėms resuspenduoti, supilkite mėginį į atskyrimo kolonėlę. Kai mėginys natūraliai ištekės, įpilkite „MaxSortin®“ ląstelių rūšiavimo buferio dviem porcijomis po 1 ml kiekvieną kartą. Surinkite ištekėjusį skystį į 15 ml centrifugavimo mėgintuvėlį.
6. Kai visas „MaxSortin®“ ląstelių rūšiavimo buferis ištekės, išimkite atskyrimo kolonėlę iš MACS rūšiavimo įrenginio ir įdėkite ją į kitą naują 15 ml centrifugavimo mėgintuvėlį. Į atskyrimo kolonėlę įpilkite 3 ml „MaxSortin®“ ląstelių rūšiavimo buferio ir stūmokliu, kuris yra kartu su atskyrimo kolonėle, tiesiogiai išstumkite skystį.
7. Įdėkite 15 ml centrifugavimo mėgintuvėlį su surinktu skysčiu į horizontalią centrifugą ir centrifuguokite 1500 aps./min. greičiu 5 minutes.
8. Po centrifugavimo supilkite supernatantą, paimkite 1 ml 1× Dulbeko fosfatiniu buferiniu tirpalu (DPBS) tirpalo ląstelėms resuspenduoti, suskaičiuokite ląsteles ir atlikite srauto citometrijos aptikimą.