Zusammenfassung der an der Kultur hämatopoetischer Stammzellen beteiligten Proteinfaktoren

Quelle: T&L Biotechnology Veröffentlichungszeitpunkt: 13.07.2023

Einführung
In den letzten Jahren StammzellenStammzellen werden zunehmend in klinischen Anwendungen eingesetzt. Der Anteil und die Menge der im menschlichen Körper vorhandenen Stammzellen sind jedoch extrem gering und können den klinischen Anforderungen nicht gerecht werden. Daher gewinnt die In-vitro-Vermehrung und -Kultivierung von Stammzellen zunehmend an Bedeutung. Aus ethischen und technologischen Gründen ist die Behandlung von Stammzellen jedoch noch mit zahlreichen Problemen behaftet. Die Oberflächenmarker hämatopoetischer Stamm-/Progenitorzellen und verschiedener Blutzelllinien sind relativ eindeutig, und die phänotypischen Merkmale der Zellen können quantitativ selektiert und getrennt werden. Ihre Funktionen können relativ frei gestaltet werden, ohne dass komplexe nachgelagerte Prozesse wie die Herstellung von „biologischen Gerüsten“ für Nerven-, Gefäß- und chirurgische Transplantationen erforderlich sind. Daher ist es das beste Modell für die Expansion und Differenzierung von Stammzellen und eignet sich auch für den direkten klinischen Einsatz.
Hämatopoietische Stammzellen verfügen über ein hohes Maß an Selbsterneuerung und vielfältiges Differenzierungspotenzial. Sie können alle reifen Blutzellen wie rote und weiße Blutkörperchen, Blutplättchen und Lymphozyten produzieren und das gesamte hämatopoetische System regenerieren. Die In-vitro-Expansion hämatopoetischer Stammzellen erfordert den Erhalt ihrer Selbsterneuerungsfähigkeit bei gleichzeitiger Verhinderung ihrer Differenzierung, was diese Technologie äußerst anspruchsvoll macht. Zahlreiche Experimente der letzten Jahre haben gezeigt, dass die Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen von Zytokinen abhängt. Wir fassen die Faktoren und ihre Wirkungen in der hämatopoetischen Stammzellkultur kurz zusammen.

Stammzellfaktor (SCF)
Stammzellfaktor (SCF) ist ein Faktor, der durch die Verankerung und Expression des Tyrosinrezeptors c-Kit auf der Oberfläche aller HSCs wirkt. Eine fehlerhafte c-Kit-Expression führt zu einer verringerten HSC-Expansion. Derzeit enthalten fast alle in HSC-Kulturexperimenten verwendeten Zytokinkombinationen SCF. Darüber hinaus gehören sowohl SCF als auch FL3 zur Familie der Tyrosinkinaserezeptoren (TKR), die eine synergistische Wirkung auf die Expansion primitiver hämatopoetischer Zellen haben. Durch die Bindung an spezifische TKR überträgt SCF Signale an die Zellen und leitet so die frühe Teilung und Expansion von Vorläuferzellen ein, wodurch die Zellen nach Abschluss der G0-Phase expandieren und die Apoptose gehemmt wird.

Thrombopoietin (Tpo）
TPO galt ursprünglich als spezifischer Wachstumsfaktor für Megakaryozyten und gehört zu den spezifisch wirkenden Zytokinen, die die Expansion, Differenzierung, Reifung, Teilung und Bildung funktioneller Thrombozyten in Megakaryozyten unterstützen. Es ist der bevorzugte Faktor für die Expansion von Megakaryozyten. Experimente der letzten Jahre haben bestätigt, dass TPO in In-vitro-Studien eine wichtige Rolle bei der Förderung der HSC-Expansion spielt. In Kombination mit anderen Zytokinen kann es die Gesamtzahl der koloniebildenden Einheiten und die Expansionsrate von CD34+-Stammzellen erhöhen. Insbesondere in Kombination mit FL3 kann es das langfristige Wachstum und die Expansion von CD34+-Stammzellen aus Nabelschnurblut aufrechterhalten.

Interleukin-3 (IL-3)
Interleukin-3 (IL-3), auch bekannt als masT-Zelle Wachstumsfaktor ist ein pleiotropes Zytokin, das hauptsächlich von aktivierten T-Lymphozyten produziert wird und die Proliferation und Differenzierung pluripotenter HSZ und verschiedener Stammbaum-orientierter Vorläuferzellen stimulieren kann. Nach der durch IL-3 induzierten Heterodimerisierung von Oberflächenrezeptoren von Stammzellen können diese an viele Signaltransduktionsproteine ​​binden, wie etwa den Janus-Kinase-Signaltransduktor und Transkriptionsaktivator (JAK/STAT)-Signalweg, wodurch ein herunterregulierter Signalfluss stimuliert und an der Regulierung der Stammzellexpansion teilgenommen wird. IL-3 kann auch den Signalweg der extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK) und den c-Jun-Aminotransferase-Signalweg (JNK) aktivieren und so Wachstum, Expansion und Überleben von Stammzellen induzieren.

Interleukin-6 (IL-6)
IL-6 ist ein multidirektionales Zytokin, das eine wichtige Rolle in der Wirtsabwehr spielt, indem es Immun- und Entzündungsreaktionen reguliert. IL-6 wird von T-Zellen, Monozyten, Fibroblasten, Endothelzellen und Keratinozyten produziert und hat vielfältige biologische Funktionen. Es kann die B-Zell-Differenzierung und Antikörperproduktion fördern, synergistisch mit IL-3 an der Entwicklung von Megakaryozyten und der Thrombozytenproduktion beteiligt sein, die Expression von Akute-Phase-Proteinen in der Leber induzieren und den Knochenstoffwechsel regulieren. IL-6 überträgt Signale über das IL-6-Rezeptorsystem, das aus zwei Ketten besteht: IL-6Rα und gp130. STAT3 ist das entscheidende Molekül zur Aufrechterhaltung des undifferenzierten Zustands embryonaler Stammzellen, während IL-6 der initiale Promotor des JAK/STAT3-Signalwegs ist.

LFLT3-Ligand (FL)
Der FLT3-Ligand ist ein Wachstumsfaktor, der die Expansion früher hämatopoetischer Zellen reguliert. Er bindet an Zellen, die den Tyrosinkinase-Rezeptor FLT3 exprimieren. Der FLT3-Ligand selbst stimuliert nicht die Expansion früher hämatopoetischer Zellen, sondern induziert synergistisch mit anderen CSFs und Interleukinen Wachstum und Differenzierung. Im Gegensatz zu SCF hat der FLT3-Ligand keinen Einfluss auf Mastzellen. Es wurden mehrere Subtypen des FLT3-Liganden identifiziert. Die wichtigste bioaktive Form ist als extrazelluläre Domäne des Transmembranproteins (209a) auf der Zelloberfläche verankert. Das membrangebundene Isomere kann durch Proteine ​​gespalten werden, wodurch biologisch aktive, lösliche Isomere entstehen.

FMS-Chinesische Lakritze 3
Die FMS-ähnliche Tyrosinkinase 3 (FL3), die in CD34+CD38dim-Zellen stark exprimiert wird, überträgt Signale an die Zelle, indem sie an ihre spezifischen Tyrosinkinase-aktiven Rezeptoren (TKRs) bindet. FL3 wirkt auf HSC/HPC und reguliert die Hämatopoese durch Bindung an TKRs auf der Zelloberfläche. FL3 ist zudem ein sehr wichtiger stimulierender Faktor für frühe Vorläuferzellen, der die In-vitro-Expansion von HSC/HPC signifikant fördert. Es kann die allmähliche Differenzierung von CD34+-Stammzellen und den Abbau von HPC während der In-vitro-Expansion verhindern.

Transformierender Wachstumsfaktor-β
Transformierender Wachstumsfaktor-β, Transformierender Wachstumsfaktor-β1, Transformierender Wachstumsfaktor-β2 und Transformierender Wachstumsfaktor-β3-Subtypen von Säugetieren senden Signale über denselben Rezeptor aus und lösen ähnliche biologische Reaktionen aus. Es handelt sich um multifunktionale Zytokine, die Zellwachstum, -differenzierung und -bewegung sowie die Synthese und Ablagerung der extrazellulären Matrix regulieren. Transformierender Wachstumsfaktor-β (TGF-β) wird von Stromazellen des Knochenmarks produziert. Er hemmt den Eintritt früher HSC/HPC in die S-Phase, wodurch die meisten HSC/HPC in die G0-Phase gelangen.

Makrophagen-Entzündungsprotein-1 α
Das Makrophagen-Entzündungsprotein-1β (MIP-1β) ist ein natürlicher Antagonist von MIP-1α und kann die hemmende Wirkung von MIP-1α auf frühe HSC/HPC aufheben und verhindern, dass HSC in einen Ruhezustand zurückkehren.

P38
P38, ein Signalmolekül aus der Familie der mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK), hemmt die In-vitro-Expansion von HSCs unter normoxischen Bedingungen. Experimente haben gezeigt, dass oxidativer Stress p38 und p16 aktiviert, wenn HSCs zu serumfreien Kulturmedien mit TPO, SCF und FL3 hinzugefügt werden. Dies führt zu einer signifikanten Abnahme der Anzahl von Maus-HSCs.

Granulomakrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF)
Der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) ist ein Medikament, das klinisch bei verschiedenen Ursachen von Leukopenie oder Granulozytopenie eingesetzt wird. Das derzeitige Zellmobilisierungsmittel ist der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF), der nicht nur die Anzahl hämatopoetischer Stammzellen im peripheren Blut erhöht, sondern auch die Herzfunktion und andere Funktionen unterstützt.

Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF)
Zu den Wirkungen von Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktoren gehören im Allgemeinen die Antigenpräsentation, die Verbesserung der Makrophagenfunktion und die Förderung der Expansion hämatopoetischer Stammzellen. Der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor ist ein wirksames Mobilisierungsmittel für Knochenmarkstammzellen, das die Expansion autologer Knochenmarkstammzellen stimulieren und diese vom Knochenmark ins periphere Blut mobilisieren kann.

Erythropoietin (EPO)
Erythropoietin (EPO) ist der wichtigste stimulierende Faktor bei der hämatopoetischen Differenzierung. Es kann die Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen in primitive rote Blutkörperchen fördern, die Teilung und Vermehrung junger roter Blutkörperchen beschleunigen, die Synthese von Hämoglobin fördern und spielt auch eine wichtige Rolle bei der Untersuchung der durch rote Blutkörperchen induzierten Differenzierung.
Hämatopoietische Stammzellen besitzen das Potenzial zur Selbsterneuerung und multidirektionalen Differenzierung. Die Kombination verschiedener Faktoren beeinflusst die Expansion hämatopoetischer Stammzellen in unterschiedlichem Maße. Der Einsatz hämatopoetischer Stammzellen kann gezielt die Produktion multipler Zellen induzieren, was zweifellos neue Ideen für die Expansion von NK-Zellen liefert. Derzeit können NK-Zellen aus embryonalen Stammzellen und iPSCs induziert werden. Sowohl embryonale Stammzellen als auch induzierte pluripotente Stammzellen müssen jedoch zunächst in hämatopoetische Stammzellen transformiert werden, bevor sie sich zu NK-Zellen differenzieren können. Hämatopoietische Stammzellen spielen daher in diesem Prozess eine unverzichtbare Rolle. Die Vorteile von aus Stammzellen gewonnenen NK-Zellen liegen in ihrer bedarfsgerechten Verwendung, ihrer hohen Homogenität, der geringen Zytokinfreisetzung und ihrer hohen Tötungsaktivität. Daher besteht weiterhin großes Interesse an der Erforschung von aus Stammzellen gewonnenen NK-Zellen auf dem Markt. Es gibt Literatur zur Induktion von Stammzellen zu NK-Zellen. Wir konzentrieren uns hauptsächlich auf die dort genannten Faktoren.

1. NK-Zellen, die aus menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnen werden

HESCs wurden mit der murinen Knochenmarkstromazelllinie M210-B4 in einem Medium mit RPMI 1640, 15 % definiertem fetalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 1 % nichtessentiellen Aminosäuren, 1 % Penicillin/Streptomyocin und 0,1 mM β-Mercaptoethanol kokultiviert. Das Medium wurde wie zuvor beschrieben alle 2 bis 3 Tage gewechselt. Nach 17 bis 20 Tagen wurde eine Einzelzellsuspension hergestellt und CD34+CD45+-Zellen wie zuvor beschrieben isoliert. Isolierte Zellen wurden in eine zweite Kokultur mit der murinen fötalen Leber-abgeleiteten Stromazelllinie AFT024 in einem Medium überführt, das eine 1:2-Mischung aus Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium/Ham F12, 20 % hitzeinaktiviertem Humanserum AB, 2 mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomyocin, 5 ng/ml Natriumselenit, 50 μM Ethanolamin, 25 μM -Mercaptoethanol, 20 mg/ml Ascorbinsäure, Interleukin-3, Stammzellfaktor, IL-15, Fms-ähnlichem Tyrosinkinase-3-Ligand und IL-7 enthielt. Die Zellen wurden alle 5 bis 6 Tage durch einen halben Mediumwechsel mit frischem Medium versorgt. Nach 30 bis 35 Tagen in Kultur wurden die Zellen geerntet, durch einen 70-μm-Filter gefiltert und für weitere Analysen verwendet.

2. NK-Zellen, die aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gewonnen werden

Wir ernteten 18–21 Tage alte Zellen zur Anreicherung von CD34+ CD45+ Vorläuferzellen. Hunderttausend CD34+ CD45+ Zellen wurden mit 1 ml NK-Zell-initiierenden Zytokinen (IL-3, IL-7, IL-15, Stammzellfaktor und FMS-ähnlicher Tyrosinkinase-Rezeptor-3-Ligand) auf EL08-1D2-Stroma platziert. Die NK-Zellkulturen wurden alle 4–5 Tage mit 0,5 ml zytokinhaltigem Medium aufgefrischt. Reife NK-Zellen wurden nach 28–35 Tagen Kultur auf EL08-1D2 gemessen.

T&L-Stammzell-bezogene Zytokine und Wachstumsfaktoren

Über T&L
T&L Biotechnology Ltd., gegründet 2011, konzentriert sich auf die Forschung und Entwicklung von GMP-konformen Rohstoffen und Reagenzien für die Zell- und Gentherapie (CGT). Wir verpflichten uns, zuverlässige Produkte und Dienstleistungen für die Biowissenschaften anzubieten.